James Maitland Stewart sinh ngày 20 tháng 5 năm 1908 tại Indiana, Pennsylvania, là con trai của Elizabeth Jackson Ruth và Alexander Maitland Stewart, chủ một cửa hàng đồ ngũ kim,[2] vốn là người gốc Scotland.[3][4] Tổ tiên bên ngoại, họ Jackson đã tham gia Cách mạng Mỹ, Chiến tranh Mehico 1912 và nội chiến.[5] Là con cả trong ba anh em (hai em gái là Virginia và Mary), ông rất được kì vọng sẽ nối nghiệp kinh doanh truyền thống đã ba thế hệ của gia đình.

Stewart nhập học tại học viện Mercersburg. Tại đây, ông tỏ ra có năng khiếu đặc biệt trong nhiều lĩnh vực như âm nhạc, bóng đá, điền kinh. Ông cũng phụ trách mĩ thuật cho tờ báo hàng năm của trường và là thành viên của dàn hợp xướng. Cũng tại Mercersburg, lần đầu tiên James đứng trên sân khấu, vai Buquet trong vở The Wolves.

Stewart nuôi ước mơ trở thành phi công, nhưng bị cha cấm đoán nên thay vì Học viện Hải quân Hoa Kỳ, ông vào học tại Đại học Princeton, ngành kiến trúc. Tại đây, ông là một sinh viên xuất sắc và thường được trao học bổng.

Năm 1931, ông gặp đôi vợ chồng mới cưới Henry Fonda và Macgaret Sullavan tại Baltimore, Maryland. Cả hai đều là thành viên đoàn kịch University Players mới thành lập ở Massachusetts và đang diễn ở Maryland một mùa đông.[6] Sau khi tốt nghiệp Princeton năm 1932, Stewart gia nhập đoàn kịch. Cuộc hôn nhân giữa Fonda và Sullavan cũng chấm dứt.[7] Stewart và Fonda trở thành đôi bạn vô cùng thân thiết, suốt mùa hè năm 1932, họ ở chung một căn hộ, với cả Joshua Logan và Myron McCormick.[8] Sau đó, cả hai tới New York và cũng lại ở cùng nhau. Cùng với đoàn University Players, Stewart ra mắt tại Broadway với vai một tài xế trong vở hài kịch Goodbye Again và chỉ có vẻn vẹn hai câu thoại. The New Yorker nhận xét "Anh tài xế James Stewart... bước lên trong vòng 3 phút và đi xuống trong những tràng pháo tay vang dội."[9]

Vở kịch khá thành công, nhưng khi này các rạp ở Broadway cũng bị ảnh hưởng bởi khủng hoảng kinh tế và nhiều vở kịch bị cắt giảm. Đóng kịch tại Broadway một thời gian nữa, năm 1934, ông tới Hollywood và ký hợp đồng với MGM vào tháng 4 năm 1935. Ông đóng một vai phụ trong bộ phim đầu tay The murder Man, diễn viên chính Spencer Tracy. Nhờ sự giúp đỡ của Margaret Sullavan, năm 1936, Stewart sang Universal Pictures để đóng vai chính đầu tiên trong Next Time We Love, đạo diễn Christopher Tyler. Năm 1936, trở lại MGM, ông xuất hiện trong một số phim hài như Wife vs. Secretary, Small Town Girl, Speed và Born to Dance. Diễn xuất của Stewart trong Born to Dance được đánh giá khá cao vì phong cách độc đáo và vẻ quyến rũ trẻ trung. Leland Hayward, người chồng tương lai của Margaret Sullavan, nhận làm quản lý cho ông. Hayward bắt đầu lập kế hoạch phát triển sự nghiệp của Stewart.